En 1940, après l'invasion des Pays-Bas, Klaus Barbie y est envoyé au sein d'un détachement de la Sipo-SD (Sicherheitspolizei und Sicherheitsdienst, police de sécurité - État - et service de sécurité - du parti nazi) à la section VI (Amt VI, Ausland-SD, renseignements à l'étranger) chargée de la préparation du débarquement en Grande-Bretagne. Avant même que celui-ci ne soit annulé, Klaus Barbie est muté à la section IV (Amt IV, improprement appelée Gestapo, en fait formée des sections [Abteilungen] II et III de la Gestapo et de la section centrale [Zentralabteilung] III2 du SD Hauptamt). Dans ce cadre, d'abord à La Haye, puis à Amsterdam, il participe activement à la poursuite et à la rafle des juifs, des francs-maçons et des émigrés allemands. Il " travaille " avec tant de zèle qu'en octobre 1940, il est promu SS-Obersturmführer (lieutenant SS). Pour avoir été l'un des officiers les plus énergiques dans l'assaut du ghetto juif d'Amsterdam et pour avoir commandé des pelotons d'exécution, il est décoré de la croix de fer de seconde classe (Eisernes Kreuz II.Klasse) le 20 avril 1941. Par la suite, Barbie aurait été envoyé en URSS, de l'été 1941 au printemps 1942, dans un commando spécial de la Sipo-SD, chargé de la lutte contre les partisans sur les arrières de l'armée allemande (J'avais suivi un stage de parachutisme [en Russie en 1941. Au printemps 1942, comme il est bien noté et qu'il parle français, Klaus Barbie est nommé chef de la sécurité à Gex, sous-préfecture de l'Ain en France, à proximité de la frontière suisse. En fait, une mission délicate l'attend : il doit enlever Alexander Foote, un agent secret travaillant pour l'URSS à Genève. Barbie réussit à soudoyer le chef d'un poste de la garde-frontière suisse et s'introduit en Suisse par le poste de Prévessin-Moëns, douane proche de sa résidence privée, avec une voiture, mais Alexander Foote a disparu … En juin 1942, Klaus Barbie est affecté au KDS (Kommando der Sipo-SD) de Dijon, puis, après l'invasion de la zone libre en France par les Allemands en novembre 1942, au KDS de Lyon (commandé par Rolf Müller, puis, début 1943, par Fritz Hollert et, à partir de l'été 43, par Werner Knab) où il prend le commandement de la section IV (lutte contre les résistants, les communistes, les juifs …). A partir de Février 1943, Barbie devient le chef de la Gestapo de la région lyonnaise (troisième officier, par ordre d'importance, au sein du KDS de Lyon). Sous ses ordres, sont torturés et exécutés de nombreux résistants, dont Jean Moulin. Il arrête aussi personnellement, à la demande de Ribbentrop, en août 1943, Albert Lebrun et André François-Poncet en Isère. Surnommé " le boucher de Lyon ", il donne l'ordre d'exécuter de nombreux otages et de déporter des milliers de Juifs à Drancy — étape intermédiaire avant Auschwitz. Parmi ses victimes, se trouvent les 86 personnes arrêtées le 9 février 1943 au siège de l'UGIF, situé 12, rue Sainte-Catherine à Lyon, mais aussi les 44 enfants d'Izieu raflés le 6 avril 1944. Le 11 août de la même année, Barbie réussit à faire partir directement de Lyon pour Auschwitz le dernier convoi de déportés avec 650 personnes dont 342 non-juifs et 308 juifs. Lors de son procès, il est accusé d'avoir fait fusiller 22 otages, dont des femmes et des enfants, en représailles d'un attentat sur deux policiers allemands en 1943, d'avoir torturé ou fait torturer au moins une vingtaine de personnes en 1943 et d'en avoir fait fusiller au moins une quarantaine la même année, d'avoir fait fusiller 70 Juifs à Bron et beaucoup d'autres parmi les 120 prisonniers de la prison Montluc exécutés à Saint-Genis-Laval durant l'été 1944, où il est vrai que, selon Max Payot, un agent français de la Gestapo, Fritz Hollert, deuxième officier du KDS de Lyon, donc supérieur à Klaus Barbie, est présent.

Durant le premier semestre de l'année 1944, Barbie dirige également le commando de la Sipo-SD qui accompagne les troupes de répression des maquis, notamment dans l'Ain et le Jura : il torture, tue ou fait tuer de nombreux villageois censés (voir discussion) soutenir les maquisards. Il est également très actif du côté savoyard de la frontière franco-suisse, lieu de passage de clandestins vers la Suisse. Accompagné de son interprète Gottlieb Fuchs, il conduit des interrogatoires accompagnés d'actes de torture à l'hôtel Pax d'Annemasse en Haute-Savoie. En septembre 1944, Klaus Barbie se trouve dans les Vosges. Le 5 septembre, sa présence est attestée à Bruyères avec de nombreux membres de la Sipo-SD de Lyon : le SS-Obersturmbannführer (lieutenant-colonel SS) Werner Knab, les sous-officiers Harry Stengritt et Krüll, des collaborateurs du PPF avec à leur tête Marcel Bergier et Charles Marandin, ainsi qu'une centaine d'auxiliaires français. Le 8 septembre, Barbie se rend à Rehaupal avec l'objectif de localiser un maquis. Le 14 septembre 1944, le SS-Sturmbannführer (commandant SS) Wanninger recommande Klaus Barbie - déjà jugé dans un rapport de 1940 comme " discipliné, travailleur, honnête, amical, bon camarade, officier irréprochable " - pour une promotion au grade de SS-Hauptsturmführer (capitaine SS) en ces termes : " Klaus Barbie est connu au Quartier général comme un chef SS enthousiaste, qui sait ce qu’il veut. Il a un talent certain pour le travail de renseignement et pour la recherche des criminels. Sa plus grande réussite réside dans la destruction de nombreuses organisations ennemies. Le Reichsführer-SS Heinrich Himmler a exprimé sa gratitude à Barbie dans une lettre personnelle qui le félicitait pour la qualité de son travail dans la recherche des criminels et la lutte contre la Résistance. Barbie est [un officier] sur lequel on peut compter aussi bien sur le plan psychologique que sur le plan idéologique. Depuis sa formation et son emploi au sein de SD, Barbie a mené une carrière assidue en tant que directeur d’un service supérieur et, s’il n’y a pas d’objection, il est recommandé qu’il soit promu SS-Hauptsturmführer. " Après la Libération de la France, Barbie parvient, blessé, à gagner la ville de Baden-Baden en Allemagne. Le 9 novembre 1944, il est promu SS-Hauptsturmführer. En poste à Halle, puis à Düsseldorf et à Essen, il termine la guerre à Wuppertal.

Recherché par les Alliés comme criminel de guerre, Klaus Barbie figure sur deux listes : à Londres, celle de la Commission des crimes de guerre des Nations unies (UNWCC : United Nations War Crimes Commission), sous le n° 48 et le nom de Barbier, alias Kreitz, et, à Paris, celle du Registre central des criminels de guerre et des suspects pour raisons de sécurité (CROWCASS : Central Registry of Wanted War Criminals and Security Suspects), sous le n° 57 et le nom de Barbie/Barbier/Barby/von Barbier/Klein/Kleitz/Mayer. L'ancien patron de la Gestapo de Lyon se fait discret, mais n'hésite pas à organiser, fin 1945, avec d'anciens SS, un réseau de résistance nazie. Cependant, en butte à l'indifférence de la population et à la répression des Alliés, ce réseau est bien vite infiltré et la plupart de ses membres arrêtés début 1947 (Operation Selection Board). Barbie réussit à s'échapper et à prendre contact avec d'anciens camarades qui travaillent pour les Américains contre les communistes allemands et russes. À partir du printemps 1947, il est officiellement employé par les services secrets américains qui l'utilisent, avec d’autres nazis, dans la lutte anticommuniste. En effet, au début de la guerre froide, le CIC (Counter Intelligence Corps, US Army) est vivement intéressé par l'expérience que Barbie a acquise en France contre la résistance communiste, surtout afin d'obtenir des informations sur la pénétration communiste des services secrets français, sur les activités du Parti communiste français, dans l'armée française et la zone française en Allemagne ainsi que sur celles des services secrets français dans la zone américaine. À partir de 1948, la France réclame l'extradition de Klaus Barbie. Le Counter Intelligence Corps donne trois raisons pour expliquer la protection qui lui est accordée : d'abord, que son aide est vraiment précieuse au moment de la guerre froide, ensuite, que ses prétendus crimes contre la Résistance étaient des actes de guerre et que les Français recherchent davantage la vengeance que la justice, enfin, qu'on ne peut plus faire confiance à une France submergée par les communistes qui veulent en fait interroger Barbie sur la pénétration américaine du parti communiste allemand et des services secrets français. Poursuivi notamment dans le cadre des deux procès intentés à René Hardy, suspecté d'avoir trahi Jean Moulin, Klaus Barbie est condamné par la justice française, en 1952 et 1954, à la peine capitale par contumace. En 1951, Barbie, accusé de vol par la police allemande, est exfiltré vers l’Argentine avec le concours des services secrets américains (CIA) et de Krunoslav Draganović. Sous l'identité de Klaus Altmann , il s’installe en Bolivie, obtient la nationalité bolivienne et dirige une entreprise d'exploitation du bois, puis, de 1966 ŕ 1971, une compagnie maritime qui s'adonne au trafic d'armes et de drogues au profit des dictatures militaires d’Amérique du Sud. À partir de 1964, il collabore activement avec l'armée bolivienne et donne des conseils pour la recherche et la torture des opposants. De 1965 à 1967, jusqu'à la mort de Che Guevara dans la jungle bolivienne, il semble qu'il soit de nouveau au service de la CIA. En 1971, il soutient le coup d'État du colonel Hugo Banzer et pour conforter son régime, Barbie crée une organisation paramilitaire d'extrême-droite les fiancés de la mort. Sa compagnie ayant fait faillite, il s'installe au Pérou. Cependant, l'arrivée de Beate Klarsfeld, militante allemande anti-nazi majeure de l'après-guerre, l'oblige à regagner la Bolivie. En effet, dès 1961, une enquête de la police allemande détermine que Barbie s'est réfugié en Bolivie. En 1969, lorsque sa fille Ute mariée à Heinrich Messner demande un visa pour l'Allemagne, les autorités découvrent finalement que " Klaus Altmann " est Klaus Barbie. Toutefois, face aux difficultés administratives, l'affaire est sur le point d'être classée quand les protestations de Beate Klarsfeld viennent la relancer. Néanmoins, Klaus Barbie, personnage important en Bolivie, est protégé par le régime Banzer jusqu'à sa chute en 1978, puis, après le coup d'État de 1980, par le nouveau régime dans lequel Barbie est nommé colonel honoraire des services de renseignements. Cependant, le gouvernement américain contraint le président bolivien à démissionner l'année suivante.

Après bien des péripéties et des atermoiements, après que le gouvernement français eut accordé à la Bolivie une importante aide au développement, Klaus Barbie est expulsé vers la France en Février 1983 pour avoir obtenu la nationalité bolivienne sous un faux nom. Son procès débute en mai 1987, devant la cour d'assises du Rhône. L'accusation est menée par Pierre Truche, assisté de Jean-Olivier Viout. Sa défense est assurée par l'avocat Jacques Vergès ainsi que par Jean-Martin Mbemba (avocat congolais) et par Nabil Bouaita (avocat algérien). A l'issue d'un procès de sept semaines, Barbie est condamné à la prison à perpétuité pour crimes contre l'humanité. Son procès a fait l'objet d'un enregistrement vidéo mené entre autres par le journaliste Ladislas de Hoyos qui l'avait interviewé en 1972, soit quinze ans auparavant en Bolivie et a été diffusé par la suite à la télévision. Le 25 septembre 1991, Barbie meurt en prison à Lyon, à près de 78 ans, des suites d'un cancer du sang et de la prostate.